Pcr võimendamise probleemid

PCR ja RT-PCR võimenduse tõrkeotsing

1. Mis põhjustab PCR ebaõnnestumist?
2. Kuidas PCR -i probleemi lahendada??
3. Mida teeksite, kui proovi PCR -amplifikatsioon ebaõnnestus?
4. Mis juhtub, kui lisate PCR -ile liiga palju praimerit??

Mis põhjustab PCR ebaõnnestumist?

Tavaliselt süüdistavad teadlased esimest korda vigase ensüümi või reaktiivi, kui katse ebaõnnestub, kuid PCR -i puhul on see tõenäoliselt ebaõnnestumise põhjus. Sageli on põhjuseks sügavamad sisemised probleemid, nagu praimeri disain, termotsükli parameetrid või mittespetsiifiline seondumine teiste matriitsijärjestustega.

Kuidas PCR -i probleemi lahendada??

Kontrollige valitud DNA polümeraaside amplifikatsiooni pikkust. Kasutage DNA polümeraase, mis on spetsiaalselt ette nähtud pika PCR jaoks. Valige kõrge protsessiivsusega DNA polümeraasid, mis võivad võimendada pikki sihtmärke lühema ajaga. Vähendage lõõmutamist ja pikendamistemperatuuri, et aidata praimeriga seonduda ja ensüümi termostabiilsust suurendada.

Mida teeksite, kui proovi PCR -amplifikatsioon ebaõnnestus?

Kui amplifikatsioonireaktsioon ebaõnnestub ja kahtlustate, et DNA mall on inhibiitoriga saastunud, lisage kahtlane DNA preparaat kontrollreaktsioonile koos DNA matriitsi ja praimeripaariga, mis on varem hästi võimendunud .

Mis juhtub, kui lisate PCR -ile liiga palju praimerit??

Praimerite kõrgemate kontsentratsioonide kasutamisel võivad olla järgmised mõjud: Kui praimerid suudavad moodustada dimeere, põhjustab nende kontsentratsiooni tõstmine ainult praimer-dimeeride teket ja ei paranda soovitud PCR-produkti amplifikatsiooni.